El metanálisis de los datos heterogéneos del Síndrome de Down .

El metanálisis de los datos heterogéneos del Síndrome de Down revela efectos consistentes de la dosis en todo el genoma relacionados con los procesos neurológicos.

Mireia Vilardell , Axel Rasche , Anja Thormann , Elisabeth Maschke-Dutz , Luis A Pérez-Jurado , Hans Lehrach , y Ralf Herwig .

Abreviaturas.

SD: Síndrome de Down; HSA21: cromosoma humano 21; TF: factor de transcripción; PCR: reacción en cadena de la polimerasa; RT-PCR: reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real; MALDI: Desorción / ionización por láser asistida por matriz; SAGE: Análisis serial de la expresión génica; GO: ontología de genes; ES: Células Madre Embrionarias; ID: identificador; GEO: Gene Omnibus Expression; GSEA: Gene Set Enrichment Analysis; CNV: Variación del número de copia; TFBS: sitio de enlace de factor de transcriptor.

FUNDAMENTO.

El Sindrome de Down se caracteriza por un fenotipo complejo con características que no son completamente penetrantes. Las manifestaciones más frecuentes, que casi siempre están presentes, incluyen, discapacidad intelectual, anomalías morfológicas de la cabeza y las extremidades, estatura baja, hipotonía e hiperlaxitud de los ligamentos. Otras características ocurren con menos frecuencia, como malformaciones en los órganos, en particular del corazón (50% de los recién nacidos con SD), varios tipos de obstrucciones o disfunciones del tracto gastrointestinal (4-5% de los recién nacidos con SD.), mayor riesgo de leucemia (20 veces mayor en comparación a la población normal), y aparición temprana de una neuropatología similar al Alzheimer. El SD. ha sido investigado con múltiples estudios de genómica funcional con el objetivo de comprender las bases moleculares que subyacen a los diversos aspectos de la condición.

La hipótesis patogénica más comúnmente aceptada es que el desequilibrio de la dosis de los genes en HSA21 es responsable de las disfunciones moleculares en la SD., lo que significa que los genes en el cromosoma triplicado se expresan en exceso debido a un cromosoma adicional 21, como se demostró para genes seleccionados como SOD1 y DYRK1A. Sin embargo, estudios recientes de transcriptomas globales con micromatrices han generado una imagen más compleja en el sentido de que no todos los genes HSA21 tienen un nivel de expresión elevado como se esperaba. Una hipótesis alternativa es que el fenotipo se debe a un entorno inestable resultante del desequilibrio de dosificación de los cientos de genes en HSA21 que determina una perturbación no específica de la regulación y expresión ergonómica. La variabilidad inter-individual significativamente mayor en la SD., en comparación con los euploides. Además, las dos hipótesis podrían ser coexistentes. En ambas hipótesis, se entiende que, además de las alteraciones de la expresión génica de los genes HSA21, existen numerosos efectos en todo el genoma que conducen a la desregulación de muchos genes no-HSA21 a través de vías moleculares e interacciones.

Se han realizado muchos estudios sobre los niveles de transcriptoma y proteoma para comprender la relación causal entre los genes en el desequilibrio de la dosis y los fenotipos SD. Los perfiles de expresión génica se han analizado en SD. fetal y en tejidos humanos adultos. Además, se han desarrollado dos clases de modelos de ratón para investigar la genética molecular de el SD., ya sea modelos de ratón con trisomías parciales de las regiones sinténicas de HSA21 en los cromosomas de ratón 10, 16 o 17, como Ts16, Ts65Dn y ratones Ts1Cje, o ratones transgénicos para genes específicos como SOD1. Los estudios de perfiles de expresión génica en muestras de SD humanas y modelos de ratón han mostrado una alta variabilidad en todo el genoma . Además, las diferencias debidas a las plataformas experimentales aplicadas, los tejidos específicos, las etapas de desarrollo o los segmentos triplicados en estudio introducen una gran variación en la evaluación de los efectos de SD. en todo el genoma. Aquí, los estudios integrativos y comparativos son fundamentales para el análisis de la naturaleza compleja de la expresión y regulación de genes en SD. a un nivel más general.

Se demostró que el metanálisis es una estrategia válida para extraer información consistente de datos heterogéneos, en particular con respecto a fenotipos complejos, por ejemplo, cáncer, Alzheimer y diabetes mellitus tipo 21. El propósito del metanálisis es compensar las variaciones específicas del experimento y revelar información consistente en una amplia gama de experimentos. Hasta la fecha, falta tal metanálisis de datos de SD.

En este artículo describimos un metanálisis completo de 45 estudios diferentes de SD. en humanos y ratones en el nivel de transcriptoma y proteoma, que incluyen datos cuantitativos como micromatrices de Affymetrix, estudios de RT-PCR y MALDI, así como datos cualitativos como SAGE y Western blot. analiza. Aplicamos un marco computacional establecido e identificaron 324 genes con efectos de dosis consistentes en muchos de estos estudios. Como se esperaba, observamos una alta fracción de genes HSA21=77, pero también una gran cantidad de genes no HSA21=247. Además de los genes bien investigados en el contexto de el SD., detectamos una proporción significativa de los nuevos=62. Los 324 genes se investigaron más a fondo utilizando información funcional, interacciones moleculares y análisis de promotores que revelaron motivos sobre-representados de cuatro factores de transcripción: RUNX1 , E2F1 , STAF / PAX2 y STAT3.. Con el fin de probar la relevancia de los 324 genes para los fenotipos cerebrales más generales, utilizamos datos públicos e independientes disponibles sobre patologías cerebrales no relacionadas con la SD. e identificamos un subconjunto de 79 genes del SD. que se expresaron de manera diferente en estos estudios. Los efectos de dosificación detectados pueden utilizarse como un recurso para estudios adicionales de patología de SD., experimentos funcionales y el desarrollo de terapias. Todos los datos se han aglomerado y puesto a disposición a través de un servidor web que rastrea los resultados del metanálisis.

http://ds-geneminer.molgen.mpg.de/ y que permite a la comunidad validar cualquier gen de interés a la luz de datos experimentales.

Ir:

Resultados.

Efectos de la dosis de todo el genoma.

Los efectos de la dosis de todo el genoma se calcularon con el método de puntuación numérica descrito en Material y Metodos. En total, se evaluaron 45 experimentos de casos y controles (archivo adicional , Tabla S1), la alteración para cada gen entre los estados trisómico y normal se puntuó en cada experimento, las puntuaciones de los genes se resumieron en todos los experimentos y la importancia de las puntuaciones resumidas Fue juzgado con un enfoque de Bootstrap. Este procedimiento dio como resultado un valor de puntuación de corte de 3.67 e identificó 324 genes como predominantemente afectados por SD. Los treinta genes con los efectos de dosis más altas, ya sea en Hsa21 o en otros cromosomas, se enumeran en la Tabla 1. La lista completa de genes se encuentra en el archivo adicional, Tabla S2.

Tabla 1.

Los mejores treinta efectos de dosis de SD  en  A) HSA21 y  B) otros cromosoma.

A) Efectos directos
conjunto	HUGO	PUNTUACIÓN	ENTROPÍA	CROMOSOMA	POSICIÓN INICIAL	POSISCIÓN FINAL	BANDA	CNV
ENSG00000154734	ADAMTS1	18.487	4.083	chr21	28208606	28217728	q21.3
ENSG00000159228	CBR1	17.518	4.509	chr21	37442239	37445464	q22.12
ENSG00000159140	SON	15.920	4.712	chr21	34914924	34949812	q22.11
ENSG00000142168	SOD1	15.817	4.372	chr21	33031935	33041244	q22.11
ENSG00000182670	TTC3L, TTC3	15.637	4.542	chr21	38445526	38575413	q22.13
ENSG00000142192	APP	15.489	4.412	chr21	27252861	27543446	q21.3
ENSG00000159128	IFNGR2	15.006	4.640	chr21	34757299	34851655	q22.11
ENSG00000182240	BACE2	14.156	4.140	chr21	42539728	42648524	q22.2
ENSG00000156256	USP16	13.713	4.378	chr21	30396950	30426809	q21.3
ENSG00000159131	GART	13.570	4.564	chr21	34870940	34915797	q22.11
ENSG00000157540	DYRK1A	13.163	4.405	chr21	38739236	38887680	q22.13
ENSG00000157557	ETS2	13.088	4.440	chr21	40177231	40196879	q22.2
ENSG00000159231	CBR3	12.185	3.954	chr21	37507210	37518864	q22.12	YES
ENSG00000159082	SYNJ1	11.880	4.284	chr21	33997269	34100359	q22.11
ENSG00000142188	TMEM50B	11.516	3.803	chr21	34804792	34853499	q22.11	YES
ENSG00000159110	IFNAR2	11.280	4.360	chr21	34602206	34656082	q22.11
ENSG00000157538	DSCR3	11.254	4.316	chr21	38591910	38640262	q22.13
ENSG00000157601	MX1	10.976	3.545	chr21	42792231	42831141	q22.3
ENSG00000159267	HLCS	10.764	4.183	chr21	38123493	38362536	q22.13	YES
ENSG00000159200	RCAN1	10.719	3.356	chr21	35885440	35987441	q22.12
ENSG00000159147	DONSON	10.435	4.295	chr21	34947783	34961014	q22.11
ENSG00000156261	CCT8	10.361	4.560	chr21	30428126	30446118	q21.3
ENSG00000183486	MX2	10.179	3.598	chr21	42733870	42781317	q22.3
ENSG00000154727	GABPA	9.936	4.032	chr21	27106881	27144771	q21.3
ENSG00000160200	CBS	9.284	3.907	chr21	44473301	44497053	q22.3
ENSG00000159216	RUNX1	9.129	3.783	chr21	36160098	37357047	q22.12
ENSG00000183527	PSMG1	8.903	3.733	chr21	40546695	40555777	q22.2
ENSG00000182093	WRB	8.837	4.149	chr21	40752170	40800454	q22.2
ENSG00000154736	ADAMTS5	8.746	4.221	chr21	28290231	28338832	q21.3
ENSG00000159197	KCNE2	8.654	3.660	chr21	35736323	35743440	q22.11	YES
B) efecto indirecto
Ensembl	HUGO	Score	Entropy	Chromo-some	Start position	End position	Band	CNV
ENSG00000117289	TXNIP	8.790	3.281	chr1	145438469	145442635	q21.1	YES
ENSG00000133110	POSTN	8.301	2.437	chr13	38136722	38172981	q13.3	YES
ENSG00000118785	SPP1	7.232	3.159	chr4	88896802	88904563	q22.1
ENSG00000113140	SPARC	7.035	3.338	chr5	151040657	151066726	q33.1
ENSG00000125968	ID1	6.987	3.164	chr20	30193086	30194318	q11.21
ENSG00000136235	GPNMB	6.943	2.047	chr7	23275586	23314727	p15.3
ENSG00000171951	SCG2	6.747	2.950	chr2	224461658	224467221	q36.1
ENSG00000135821	GLUL	6.604	3.702	chr1	182350839	182361341	q25.3
ENSG00000123610	TNFAIP6	6.575	2.377	chr2	152214106	152236560	q23.3
ENSG00000118523	CTGF	6.567	2.996	chr6	132269316	132272513	q23.2
ENSG00000168209	DDIT4	6.477	3.318	chr10	74033678	74035794	q22.1
ENSG00000162407	PPAP2B	6.350	3.343	chr1	56960419	57110974	p32.2
ENSG00000038427	VCAN	6.240	2.958	chr5	82767284	82878122	q14.2
ENSG00000151491	EPS8	6.194	3.143	chr12	15773076	15942510	p12.3
ENSG00000189067	LITAF	6.185	3.255	chr16	11641582	11680806	p13.13
ENSG00000164692	COL1A2	6.148	2.852	chr7	94023873	94060544	q21.3
ENSG00000204388	HSPA1B	6.109	2.550	chr6	31795688	31798031	p21.33
ENSG00000162692	VCAM1	6.012	2.533	chr1	101185305	101204601	p21.2
ENSG00000154096	THY1	5.974	3.244	chr11	119288888	119293854	q23.3
ENSG00000135919	SERPINE2	5.904	3.048	chr2	224839765	224904036	q36.1
ENSG00000172201	ID4	5.887	3.037	chr6	19837617	19840915	p22.3
ENSG00000114315	HES1	5.884	2.874	chr3	193853934	193856521	q29
ENSG00000172893	DHCR7	5.883	3.441	chr11	71145457	71159477	q13.4
ENSG00000204262	COL5A2	5.857	3.174	chr2	189896622	190044605	q32.2
ENSG00000149257	SERPINH1	5.846	3.146	chr11	75273170	75283844	q13.5
ENSG00000176697	BDNF	5.805	2.416	chr11	27676440	27743605	p14.1
ENSG00000182551	ADI1	5.782	3.081	chr2	3501693	3523507	p25.3
ENSG00000079739	PGM1	5.661	3.251	chr1	64058947	64125916	p31.3
ENSG00000108821	COL1A1	5.527	3.004	chr17	48260650	48278993	q21.33
ENSG00000187498	COL4A1	5.514	3.396	chr13	110801318	110959496	q34

Los genes identificados de meta-análisis que mostraron cambios consistentes en muchos de los diferentes experimentos en lugar de los genes que se vieron afectados por un único (o muy pocos) experimento (Figura. 1A ). Este es un hecho importante, ya que, por ejemplo, diferentes modelos de ratón tienen una cobertura diferente de genes HSA21 triplicados, y, por lo tanto, podrían introducir un sesgo específico del modelo. La consistencia de la dosis efecto se midió para cada gen con un criterio de entropía (véase Materiales y Métodos) y la Figura 1A revela una fuerte preferencia para la selección de genes de alta entropía. La puntuación más alta fueron asignados a Hsa21 genes Figura 1B. Lo que indica que las puntuaciones de meta-análisis reflejan el efecto de un cromosoma 21 adicional en la expresión génica (Tabla 1). Mientras se identificaron efectos proporcionalmente más de dosificación para Hsa21 genes (77 de 324), la mayoría de los genes (247 de 324) se encuentra en otros cromosomas destacando el impacto de todo el genoma de SD. (Figura 1C).

(Figura 1)

Caracterización de los efectos de la dosificación . A) Entropía (eje Y) versus puntuación del efecto de la dosis (eje X) para todos los genes, B) Histograma de puntuaciones para los 255 genes HSA21 accesibles con los experimentos en estudio, C) Distribución de las ubicaciones genómicas de los 324 candidatos genes, D) Ubicación citogenética de 77 genes HSA21 que muestran efectos de dosis significativos para todos los experimentos (línea azul). Además, el mismo enfoque de metanálisis se ha realizado con datos de humanos (línea verde) y ratón (línea roja) por separado. La línea amarilla traza el número relativo de genes HSA21 dentro de cada banda (densidad de genes). El eje Y muestra el porcentaje de genes significativos con respecto a todos los genes anotados para la banda cromosómica.

Los efectos de la dosis en todo el genoma subrayaron las graves consecuencias fenotípicas de la SD. causada por genes con un papel importante en el desarrollo humano, Figura S1). De los 247 genes no-HSA21, 72 se asociaron con el desarrollo, en particular con respecto al desarrollo de órganos (62 genes, GO: 0048513), desarrollo de tejidos (34 genes GO: 0009888) y desarrollo celular (30 genes, GO: 0048468). Entre estos genes se conocían interactores de los genes HSA21, por ejemplo, REST(factor de transcripción de silenciamiento RE1). REST modula la expresión de genes que codifican funciones neuronales fundamentales, incluidos los canales iónicos, las proteínas sinápticas y los receptores de neurotransmisores, y se ha relacionado con una forma hereditaria de retraso mental. Recientemente, Canzonetta et al. Demostró que la región capaz de afectar REST niveles, en células tanto de ratón y humanos, podría ser asignado a la DYRK1A locus en Hsa21 que se encontró entre la Hsa21 genes de puntuación superior (Tabla 1).

TXNIP (proteína que interactúa con la tiorredoxina) tuvo el efecto de dosis más alta (8.79) de todos los genes que no son HSA21. Tiene una asociación débil con SD. todavía (a través de S100B) pero podría desempeñar un papel importante para varios fenotipos de SD. Es una molécula de señalización clave involucrada en la homeostasis de la glucosa, la homeostasis cardiovascular y la leucemia.

El enriquecimiento de la ubicación genómica con respecto a los 324 genes se observó en las regiones de HSA21 y las respectivas regiones sinténicas en los cromosomas 16, 17 y 10 de ratón, (Figura S2). Además, en el genoma humano, se calculó el enriquecimiento adicional en chr3q24 que contenía los genes GYG1 (glicogenina), PLOD2 (involucrado en la morfogénesis ósea), PLSCR4 y CHST2(involucrado en la respuesta inflamatoria en células endoteliales vasculares).

Efectos de la dosis en HSA21.

Proporcionalmente Hsa21 contribuyó principalmente a los efectos de dosificación detectados (Figura 1C). Por otro lado, es notable que solo un tercio de todos los genes HSA21 (77 de los 255 estudiados aquí usando la anotación del genoma de Ensembl) mostraron efectos consistentes en los diferentes experimentos (ver también Discusión). Mientras que 57 genes tenían una puntuación positiva por debajo del umbral de significación de 3,67 que indica relevancia con respecto a experimentos específicos solamente, 121 genes tenían una puntuación cerca de cero que indica que los efectos de dosificación o bien se compensan o no detectados con los datos experimentales seleccionados (Figura 1B ).

Los efectos de la dosis de HSA21 incluyeron, por ejemplo, APP (proteína precursora beta-amiloide) involucrada en la formación de placa senil en el síndrome de Alzheimer y en la enfermedad de Alzheimer, SOD1 (superóxido dismutasa 1), una enzima clave en el metabolismo de los radicales libres derivados del oxígeno, DYRK1A (quinasa 1A regulada por fosforilación de tirosina (Y) de especificidad dual) implicada en la proliferación de neuroblastos, crucial para la función cerebral, el aprendizaje y la memoria, RUNX1 (factor 1 de transcripción relacionado con la rutina) que desempeña un papel fundamental en hematopoyesis normal, o GABPA(Factor de transcripción de la proteína de unión a GA, subunidad alfa 60 kDa) que codifica un dominio de unión a ADN con una gran variedad de objetivos, incluidos genes de diferentes especificidades y funciones de células / tejidos. Los genes HSA21 estaban mayormente regulados al alza en estudios de expresión génica (69 de 77), con la excepción de ocho genes que eran variables o regulados a la baja ( SLC5A3 , MRPS6 , B3GALT6 , CBS , KCNJ6 , KCNJ15 , CLDN14 , COL18A1 ). Las posibles explicaciones de esta observación podrían ser la especificidad tisular de la expresión génica como en el caso de MRPS6. Que fue mayormente regulado por incremento en muestras de cerebro y regulado por disminución en otros tejidos como el corazón o el riñón, o diferencias en la expresión génica de humanos y ratones como en el caso de CBS que fue regulado por incremento en humanos pero regulado por disminución en experimentos con ratones qué podría ser causada por la especificidad diferencial de tejido del gen ortólogo de ratón.

Tres regiones genómicas en Hsa21 se enriquecieron con los genes significativos utilizando el MSigDB_c1 base de datos de posición: chr21q22, chr21q21 y chr21q11, situada en el brazo terminal de q-(Figura 1D ). Esto contradice la hipótesis de que una sola región en HSA21 podría ser responsable de las consecuencias moleculares y fenotípicas de la SD. con solo unos pocos genes sensibles. Más bien, nuestros hallazgos respaldan estudios que identificaron más de una región HSA21 causante de fenotipos de SD, de modo que los efectos de la dosis no se distribuyeron uniformemente a lo largo del cromosoma, sino que se enriquecieron en ciertas regiones en HSA21 similares a los resultados.

Anotación funcional utilizando análisis de enriquecimiento de genes.

La anotación funcional de las vías biológicas se recuperó del ConsensusPathDB, una meta-base de datos que resume el contenido de 22 bases de datos de interacción humana. Un total de 1,695 vías predefinidas se seleccionaron con los 324 genes utilizando el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes. Un total de 277 vías se encontraron (tasa familia sabia error (FWER) <0,01) enriquecido significativamente de las cuales varias vías se asociaron con procesos neurológicos y neuropatológicos (tabla 2). Estas vías se refieren principalmente a (i) la neurodegeneración (por ejemplo, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson) y (ii) los defectos en la sinapsis (por ejemplo, Axon guia, señalizacion NGF). Además, los resultados enfatizaron el papel de los receptores de tirosina-quinasa en la patología SD. (por ejemplo, P75 (NTR): señalización mediadora o señalización de NGF a través de TRKA) que interactúan directamente con BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro). Además, nuestros resultados mostraron los efectos de la dosificación génica causados ​​directamente por los genes ubicados en HSA21 (por ejemplo, SOD1, APP, DONSON, TIAM1, COL6A2, ITSN1 y BACE2 ) o indirectamente por los interactores HSA21, destacando la complejidad intrínseca de la patología de SD. Por ejemplo, PIK3R1 la desregulación afecta a muchas de estas vías y es un interactor directo de IFNAR1, un gen SD. importante. Un efecto similar se observa para TPJ1A que tiene interacciones con genes Hsa21, JAM2 y CDLN8 ambos que muestran los efectos de dosificación consistentes (cf. Figura 2A ).

Tabla 2

Enriquecimiento de vías neuropatológicas.

PATHWAY (Base de datos de origen)	Tamaño del camino	Valor de p	FWER p-valor	Genes en HSA21	Interactores HSA21	Otros
ENFERMEDAD DE HUNTINGTONS (KEGG)	159	0	0	SOD1;Donson	DESCANSO	BDNF; SOD2
ENFERMEDAD DE ALZHEIMERS (KEGG)	147	0	0	APP;BACE2;Donson	PPP3CA;GSK3B	CAPN2
SEÑALIZACIÓN POR NGF (REACTOME)	209	0	0	ITSN1;TIAM1	PIK3R1;GSK3B	RPS6KA2;RAP1A; KRAS
GUIA DE AXON (REACTOME)	256	0	0	COL6A2	GSK3B; COL1A1;COL1A2;COL4A1;COL4A2	COL5A2;DPYSL3;RPS6KA2;LAMB1;COL3A1;COL5A1;ALCAM; KRAS
ENFERMEDAD DE PARKINSONS (KEGG)	105	0	0	Donson		UBE2G2
P75 (NTR) - SEÑALIZACIÓN MEDIA (PID)	68	0	0	APP	PIK3R1	BDNF
NOTCH (NETPATH)	61	0	0	APP	PIK3R1;GSK3B
VÍA DE SEÑALIZACIÓN DE NEUROTROFINAS (KEGG)	121	0	0		PIK3R1;GSK3B	BDNF;RPS6KA2;RAP1A; KRAS
SEÑALIZACIÓN DE NGF A TRAVÉS DE TRKA DESDE LA MEMBRANA DE PLASMA (REACTOME)	127	0	0		PIK3R1;GSK3B	RPS6KA2;RAP1A; KRAS
TRATA DE MEMBRANAS (REACTOME)	87	0	0		TJP1	GJA1; COPG
SEÑALIZACIÓN DEL RECEPTOR TRK MEDIADO POR FACTOR NEUROTRÓFICO (PID)	60	0	0	TIAM1	PIK3R1	BDNF; RAP1A;KRAS
SEÑALIZACIÓN EPO (INOH)	180	0	0		PIK3R1;GSK3B
CDC42 EVENTOS DE SEÑALIZACIÓN (PID)	68	0	0	TIAM1	PIK3R1;GSK3B	EPS8; SI1
INTERACCIONES L1CAM (REACTOME)	93	0	0			LAMB1;ALCAM1;RPS6KA2

Figura 2

Interacciones moleculares de los genes HSA21. A) Interacciones de genes HSA21 (rojo) con genes no HSA21 (otros colores). Los mismos colores de los nodos genéticos se refieren al mismo cromosoma. B) Ejemplo de regulación descendente consistente de DNAJB1 como consecuencia del desequilibrio HSA21. 

Efectos de la dosis en la regulación transcripcional.

La desregulación de la regulación transcripcional se informa ampliamente en la SD. Entre los 324 genes significativos estaban 13 factores de transcripción ( TF ) ( PSIP1, RBPJ, TCF4, HES1, ETS2, BACH1, RUNX1, GABPA, SNAI2, REST, LITAF, EGR1, FOS ), 6 TFs ( PSIP1, HOXC8, DLX5, HIVEP3) , ZNF187, ATF6 ) tuvieron un enriquecimiento significativo de sus objetivos según lo recuperado por la base de datos TRANSFAC. Además, 57 TF tuvieron un enriquecimiento significativo de sus proteínas interactivas cuando se juzgaron con interacciones físicas obtenidas de ConsensusPathDB. En total, se identificaron 70 TF diferentes como afectados (directa o indirectamente) por desequilibrios de dosificación. Tabla S3. Las categorías GO indican un amplio impacto de la regulación transcripcional para el desarrollo neurológico, el desarrollo del sistema nervioso central ( RUNX1 y TP53 ), el desarrollo del sistema nervioso ( DLX5, FOS, HES1, STAT3 y EP300 ), la axonogénesis ( DLX5 , NOTCH1 y CREB1 ), la diferenciación de las neuronas ( HOXC8 , NOTCH1 y RUNX1), la regulación negativa de la diferenciación neuronal ( JUNHES1 , NOTCH1 y REST ) y la regulación de la plasticidad sináptica neuronal a largo plazo y el aprendizaje o la memoria ( EGR1 y). Otras categorías prominentes se refieren al desarrollo de órganos ( RBPJ, ETS2, GABPA y SNAI2 ) y la respuesta al estrés ( ATF6 , FOS y RELA ).

Además, analizamos las secuencias promotoras de los 324 genes para el enriquecimiento de los sitios de unión del factor de transcripción utilizando el software AMADEUS. Enriquecimiento significativo se calculó para 4 TF motivos, E2F1, RUNX1, STAF / PAX2 y STAT3 (tabla  3). El enriquecimiento fue evidente para RUNX1, que se encuentra entre los genes más estudiados implicados en la SD. La implicación de E2F1 en SD también se informó anteriormente y podría ser responsable de la proliferación celular dañada documentada para el hipocampo, el cerebelo y los astrocitos de los modelos de ratones SD.

Tabla 3
TFBSs enriquecidos.

TF	Descripción	Cromo-algunos	Valor P	Motivo de unión	Hebra
E2F1	Factor de transcripción E2F 1	chr20	9.3 * 10-18	[C / t] [C / a] [G / c] C [c / a] [C / g] [G / c] [C / T] [G / c] A	-
RUNX1	factor de transcripción relacionado con el runt 1	chr21	4.0 * 10-18	[C / a / t] [T / a / g] [G / C] {A} [G / c] {A} T [C / A] [G] [C / a / t / g]	+
STAF /  PAX2	caja emparejada 2	chr10	8.4 * 10-18	[A / g] [A / g] A [C / T / a] [T / g / a] [T / c] [C / t] [C / g] [C / a]	+
STAT3	transductor de señal y activador de la transcripción 3 (factor de respuesta de fase aguda)	chr17	8.4 * 10-17	GAA [A / T] [C / T] G [C / T] [C / g / t] [A / T] [C / T / g]	+

Los motivos de unión se han representado utilizando la nomenclatura IUPAC e incorporando minúsculas para bases de baja frecuencia.

Efectos de dosificación e interacciones moleculares.

Las interacciones moleculares entre los 324 genes significativos sobre Hsa21 y en otros cromosomas exhiben una compleja red de soporte el importante papel de las interacciones físicas como transmisor de los efectos de dosificación (Figura 2A). Las consecuencias de Hsa21 triplicación en los genes que interactúan era bastante estable como (Figura 2B) demuestra. Por ejemplo, DNAJB1 (homólogo de DnaJ (Hsp40), subfamilia B, miembro 1) y PPP3CA (proteína fosfatasa 3, subunidad catalítica, isozima alfa, datos no mostrados), ambos interactuando con SOD1, se regularizaron de manera consistente y significativa en los experimentos con microarreglos humanos como indican los cambios en los valores y los valores de p. Se observaron tendencias opuestas para TJP1 y RHOQ .

Evaluación de la relevancia general de los efectos de la dosis de SD. para procesos neurológicos.

También nos interesó identificar, entre los 324 genes, aquellos que eran relevantes para otros trastornos cerebrales. Para lograr esto, evaluamos 19 conjuntos de datos independientes derivados de datos de micromatrices disponibles públicamente, (Tabla S4). Estos estudios siguieron preguntas de investigación heterogéneas sobre diferentes patologías cerebrales e identificaron un total de 623 genes expresados ​​diferencialmente. Analiza enriquecimiento conjunto de genes con los 324 genes y las listas correspondientes de genes expresados diferencialmente fueron significativas para 10 de estos 19 estudios con 79 superposición de genes (Figura 3A). Además, utilizamos la base de datos HSA21 http://chr21.molgen.mpg.de/hsa21, un recurso de las hibridaciones de ARN in situ en secciones post-natales de cerebro de ratón, para proporcionar evidencia de apoyo independiente de la expresión cerebral de estos 79 genes como se muestra, por ejemplo, para BACH1 (factor 1 de transcripción de cremallera de leucina básica) 3B y 3C )

figura 3

Efectos de la dosis relacionados con el cerebro . A) Diagrama de Venn que muestra la superposición de los 324 genes significativos con 623 genes identificados por estudios independientes en ratones relacionados con fenotipos cerebrales; B) ARN hibridaciones in situ de BACH1 en rodajas de cerebro embrionario de ratón postnatal. C) Hibridación in situ de TTC3 en el mismo tejido. Imágenes proporcionadas por el consorcio HSA21; http://chr21.molgen.mpg.de/hsa21). D) Agrupación jerárquica de 79 genes relacionados con trastornos cerebrales generales que no son SD. con los conjuntos de datos de expresión del gen SD. La agrupación se realizó con el software J-Express 2009 utilizando la correlación de Pearson como medida de similitud y enlace completo como regla de actualización.

Además, investigamos los patrones de expresión de los 79 genes en los experimentos de microarrays SD. utilizados para este metanálisis y pudimos identificar firmas relacionadas con el cerebro, por ejemplo, una clara regulación al alza en los tejidos cerebrales para el grupo que contiene C14orf147, IVSNS1ABP, B2M , TPJ1, SPARC, CTGF, COL4A1 y FSTL1 (Figura 3D ).

Nuevos efectos de dosificación.
Para identificar "novela" SD-relevante efectos de dosificación se excluyeron de los 324 genes (i) Hsa21 genes, (ii) genes que interactúan con Hsa21 genes, así como (iii) genes que se asociaron con SD. en la literatura (Tabla  4 ). Los candidatos restantes (N = 62) comprendían genes relacionados con BDNF ( SST ), genes de la ruta MAPK ( KRAS , IGF1R , GNG11 y RAP1A ), genes relacionados con leucemia ( SFRP1 ) y Rho-proteínas ( DHCR7 y RAB21 ). SST se encontró como coexpresado en estudios previos conTAC1, Que también es importante en nuestra meta-análisis y ambos mostraron una fuerte correlación entre los estudios DS (Figura 4A).

Tabla 4
Nuevos efectos de dosis de DS

Ensembl	HUGO	Puntuación	Entropía	Cromosoma	Posicióninicial	Posiciónfinal	Banda	CNV
ENSG00000133110	POSTN	8.301	2.437	chr13	38136722	38172981	q13.3	SÍ
ENSG00000135919	SERPINE2	5.904	3.048	chr2	224839765	224904036	q36.1
ENSG00000172893	DHCR7	5.883	3,441	chr11	71145457	71159477	q13.4
ENSG00000135744	AGT	5.467	2.799	chr1	230838269	230850043	q42.2
ENSG00000159176	CSRP1	5.424	3.136	chr1	201452658	201478584	q32.1
ENSG00000178695	KCTD12	5.344	2.373	chr13	77454312	77460540	q22.3
ENSG00000183087	GAS6	5.129	2.904	chr13	114523524	114567046	q34
ENSG00000164106	SCRG1	5.127	2.728	chr4	174309300	174320617	q34.1
ENSG00000166923	GREM1	5.073	1.486	chr15	33010175	33026870	q13.3	SÍ
ENSG00000163754	GYG1	4.933	3.129	chr3	148709128	148745419	q24
ENSG00000155380	SLC16A1	4.878	2.927	chr1	113454469	113499635	p13.2	SÍ
ENSG00000166033	HTRA1	4.811	3.101	chr10	124221041	124274424	q26.13	SÍ
ENSG00000145632	PLK2	4.785	2.811	chr5	57749809	57756087	q11.2
ENSG00000115380	EFEMP1	4.726	2.257	chr2	56093102	56151274	p16.1
ENSG00000060237	WNK1	4.637	2.765	chr12	862089	1020618	p13.33	SÍ
ENSG00000103888	KIAA1199	4.581	0.885	chr15	81071684	81244117	q25.1
ENSG00000113810	SMC4	4.462	3.372	chr3	160117062	160152750	q25.33
ENSG00000198356	ASNA1	4.431	3.067	chr19	12848306	12859137	p13.2
ENSG00000122952	ZWINT	4.415	3.266	chr10	58116989	58121036	q21.1
ENSG00000157005	SST	4.401	1.954	chr3	187386694	187388187	q27.3
ENSG00000117519	CNN3	4.384	3.253	chr1	95362507	95392834	p21.3
ENSG00000107104	KANK1	4.352	2.508	chr9	470291	746105	p24.3	SÍ
ENSG00000151414	NEK7	4.329	1.848	chr1	198126121	198291550	q31.3
ENSG00000044574	HSPA5	4.261	3.449	chr9	127997132	128003609	q33.3
ENSG00000128590	DNAJB9	4.251	3.241	chr7	108210012	108215294	q31.1
ENSG00000127920	GNG11	4.226	2.747	chr7	93551011	93555831	q21.3
ENSG00000008083	JARID2	4.161	3.203	chr6	15246527	15522253	p22.3
ENSG00000119938	PPP1R3C	4.159	3.036	chr10	93388199	93392858	q23.32
ENSG00000049245	VAMP3	4.146	3.036	chr1	7831329	7841492	p36.23
ENSG00000120694	HSPH1	4.129	3.310	chr13	31710762	31736502	q12.3
ENSG00000168214	RBPJ	4.127	3.291	chr4	26321332	26436753	p15.2
ENSG00000162909	CAPN2	4.111	3.020	chr1	223889347	223963720	q41	SÍ
ENSG00000166147	FBN1	4.106	2.070	chr15	48700505	48937918	q21.1	SÍ
ENSG00000100941	PNN	4.081	3.380	chr14	39644425	39652422	q21.1
ENSG00000132640	BTBD3	4.074	3.478	chr20	11871371	11907257	p12.2	SÍ
ENSG00000128708	HAT1	4.064	3.158	chr2	172778958	172848599	q31.1	SÍ
ENSG00000176105	SI1	4.047	2.855	chr18	721588	812327	p11.32
ENSG00000152377	SPOCK1	4.025	3.083	chr5	136310987	136835037	q31.2
ENSG00000136026	CKAP4	4.018	2.754	chr12	106631659	106641908	q23.3
ENSG00000198121	LPAR1	3.979	2.858	chr9	113635543	113800738	q31.3
ENSG00000140443	IGF1R	3.951	3.376	chr15	99192200	99507759	q26.3
ENSG00000198730	CTR9	3.891	3.310	chr11	10772803	10801287	p15.3
ENSG00000162616	ADNJB4	3.869	3.035	chr1	78444859	78483648	p31.1
ENSG00000104332	SFRP1	3.825	2.587	chr8	41119483	41166992	p11.21
ENSG00000116473	RAP1A	3.824	2.769	chr1	112084840	112259313	p13.2
ENSG00000172500	FIBP	3.804	3.309	chr11	65651211	65656010	q13.1	SÍ
ENSG00000133703	KRAS	3.801	3.338	chr12	25358182	25403854	p12.1
ENSG00000163032	VSNL1	3.798	3.099	chr2	17720393	17838285	p24.2
ENSG00000134684	YARS	3.765	3.431	chr1	33240840	33283754	p35.1
ENSG00000105854	PON2	3.764	2.862	chr7	95034179	95064510	q21.3
ENSG00000148943	LIN7C	3.763	3.033	chr11	27516124	27528303	p14.1
ENSG00000162734	PEA15	3.747	3.418	chr1	160175127	160185166	q23.2
ENSG00000103187	COTL1	3.731	3.304	chr16	84599200	84651683	q24.1	SÍ
ENSG00000198648	STK39	3.722	3.439	chr2	168810530	169104651	q24.3
ENSG00000100577	GSTZ1	3.713	2.759	chr14	77787230	77797939	q24.3
ENSG00000080371	RAB21	3.707	3.312	chr12	72148658	72181150	q21.1	SÍ
ENSG00000136108	CKAP2	3.688	2.960	chr13	53029495	53050485	q14.3
ENSG00000066583	ISOC1	3.686	2.655	chr5	128430442	128449721	q23.3
ENSG00000143420	ENSA	3.681	3.276	chr1	150573327	150602098	q21.3
ENSG00000114353	GNAI2	3.680	3.138	chr3	50263724	50296787	p21.31	SÍ
ENSG00000140105	Guerras	3.671	2.994	chr14	100800125	100842680	q32.2
ENSG00000018625	ATP1A2	3.670	2.733	chr1	160085549	160113381

Figura 4

Novedosos efectos de dosificación de SD. visualizados con el navegador web . A) SST y TAC1 han sido reportados previamente como actuando en un complejo. El perfil desregulado de estos genes correlacionados se mostró aquí con la vista de cambio del navegador web. B) HSPA5 es un gen novedoso para SD. implicado en la neurodegeneración que también es un objetivo del ATF6 TF cuyo conjunto de objetivos se enriqueció con genes significativos. El histograma muestra los valores de p para este gen en estudios individuales. C) KANK1, un gen relacionado previamente con la parálisis cerebral hereditaria paternal, muestra una tendencia constante de regulación hacia arriba en los estudios considerados como se muestra con la vista de cambio del navegador web.

Figura 4

Novedosos efectos de dosificación de SD. visualizados con el navegador web . A) SST y TAC1 han sido reportados previamente como actuando en un complejo. El perfil desregulado de estos genes correlacionados se mostró aquí con la vista de cambio del navegador web. B) HSPA5 es un gen novedoso para SD. implicado en la neurodegeneración que también es un objetivo del ATF6 TF cuyo conjunto de objetivos se enriqueció con genes significativos. El histograma muestra los valores de p para este gen en estudios individuales. C) KANK1 , un gen relacionado previamente con la parálisis cerebral hereditaria paternal, muestra una tendencia constante de regulación hacia arriba en los estudios considerados como se muestra con la vista de cambio del navegador web.

Candidatos novedosos están asociadas con trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Alzheimer ( VSNL1 ), enfermedad priónica ( SCRG1, HSPH1, HSPA5 (Figura 4B ) y CTR9 ) y la degeneración relacionada con la edad ( GAS6 y GNG11 ). Además, los candidatos podrían explicar las características evidentes de SD. (archivo adicional, tabla S5): (i) genes relacionados con neurogénesis y crecimiento de neuritas ( LPAR1, LIN7C , JARID2 , GREM1, SERPINE2, IGFR1 y SPOCK1) Que podría estar relacionado con retraso mental o deterioro cognitivo, (ii) los genes implicados en la sinapsis ( AGT, KRAS, ATP1A2, GNAI2, SST y Lin7c ) (iii) proteínas relacionadas con el citoesqueleto ( KANK1; la Figura 4C ), CKAP2, CKAP4, HAT1, NEK7 y VAMP3 ), (iv) genes de degeneración macular  o genes ( HTRA1 y EFEMP1 ) asociados con problemas visuales relacionados con la edad, (v) (AGT, CNN3, FBN1, RBPJ, PON2, POSTN, RAP1A, WNK1 genesy STK39 ) que estaban relacionados con deficiencias cardíacas y podrían ser candidatos para explicar esta característica SD.  y (vi) genes relacionados con cáncer ( BTBD3, DNAJB4, FIBP  y GSTZ1 ).

Estos ejemplos muestran que el enfoque del metanálisis identificó múltiples genes adicionales que podrían estar involucrados en la patología de la SD. Para permitir que la comunidad verifique cualquier gen particular de interés para la relevancia de SD. en los estudios bajo análisis, hemos agrupado toda la información del metanálisis en una interfaz WEB 

http://ds-geneminer.molgen.mpg.de / . Ejemplos de posibles puntos de vista y la información se muestran en la Figura 4 .

:

Discusión.

El enfoque del metanálisis estadístico fue descrito previamente por Rasche et al. La puntuación calculada con meta-análisis se correlaciona con la entropía (Figura 1A) que indica la capacidad de identificar los efectos generales de dosificación a través de muchos experimentos que pueden ser de más relevancia fenotípica que los muy específicas. Archivo adicional, las Figuras S3A y B proporcionan una visión general de las diferentes fuentes de datos, incluidos dos organismos (humanos y ratones), diferentes tejidos (cerebro, corazón y otros), diferentes etapas de desarrollo (adulto, postnatal, embrionario) y diferentes Modelos de ratón (Ts65DN, Ts1Cje, Tc1). Es per se interesante que, a pesar de tal heterogeneidad, los efectos comunes de la dosificación podrían identificarse y debería destacarse que los datos del genoma completo eran bastante sólidos en todos los experimentos. Archivo adicional, la Figura S3D muestra la correlación general de los valores cuantitativos de PCR y los valores de microMatrices promediados de todos los experimentos con solo unos pocos genes en los sectores no concordantes del gráfico (puntos rojos).

La puntuación utilizada en este análisis permite detectar genes que podrían estar regulados hacia arriba o hacia abajo en diferentes estudios. En el archivo adicional, tabla S6, se proporciona una descripción general de los cambios en los genes en los diferentes experimentos . Debido a que los genes pueden cambiar su nivel de expresión según el estado de desarrollo, el tejido o debido a otras variables, esperamos que esta flexibilidad permita verificar la hipótesis de alteraciones aleatorias, así como la hipótesis de una mayor expresión de los genes HSA21. Detectamos un claro enriquecimiento de genes regulados en la parte terminal q-de Hsa21 (Figura 1D) y archivo adicional, (Figura S2). Sin embargo, no se identificó una sola región, sino varias regiones más pequeñas en HSA21 que aglomeran una gran cantidad de efectos de dosis significativos. Este hallazgo también se elaboró ​​antes (Korbel et al. y Lyle R et al.) utilizando dos conjuntos de datos independientes para caracterizar las regiones moleculares HSA21 en un conjunto de pacientes con SD. con duplicaciones parciales.

Se estudiaron 255 genes HSA21 combinados con los conjuntos de sondas de los micromatrices. De éstos, sólo 77 mostraron efectos de dosificación consistentes (Figura 1). Si bien los genes HSA21 165 tenían valores de puntuación diferentes de cero que indican una respuesta en algunos de los estudios de micromatrices, 90 genes HSA21 no respondieron en absoluto y proporcionan evidencia de un fuerte mecanismo de compensación de dosis. Por otro lado, estas cifras también podrían reflejar la limitación de detectar cambios de pliegue confiables de baja magnitud con la tecnología de micromatrices. Además, los experimentos cubrieron solo una cantidad limitada de tejidos, por lo que es probable que algunos genes se hayan perdido simplemente porque no respondieron en los tejidos bajo análisis. Sin embargo, tener el cerebro como la fuente dominante de muestro genoma completo debería garantizar la expresión de la mayoría de los genes. Los datos de micromatrices se enfocaron en la plataforma Affymetrix para reducir la varianza que surge de las inconsistencias de la plataforma. y también encontraron relevancia de los efectos de dosificación seleccionados con respecto a otros tejidos (daos no mostrados). Se realizó una validación cruzada adicional con un conjunto de datos de micromatrices independientes. Estos autores compararon líneas celulares linfoblastoides humanas derivadas de pacientes con SD. y controles normales con una matriz HSA21 hecha a medida. Yahya-Graison et al. Ellos dividieron las relaciones de expresión en cuatro clases: los genes de clase I y clase II estaban significativamente regulados al alza, mientras que los genes de clase III y clase IV fueron compensados ​​o mostraron una respuesta variable. Nuestro metanálisis reveló un alto grado de concordancia teniendo en cuenta que el modelo celular, la plataforma y la metodología utilizada eran completamente diferentes. Las puntuaciones del metanálisis fueron significativamente más altas para los genes de clase I y II que para los genes de clase III y IV (valor de p <0.01, archivo adicional, figura S4). 25 de los 39 genes de clase I-II revelaron una puntuación significativa en nuestro metanálisis (75%).

En este estudio monitorizamos las interacciones moleculares de genes Hsa21 que podría funcionar como conductores de los efectos de dosificación (Figura 2A). Por ejemplo, (i) TJP1 (proteína de unión estrecha ZO-1) interactúa con dos genes HSA21, JAM2 y CLDN8 , (ii) FOS (homólogo de oncogene viral de osteosarcoma murino FBJ) interactúa con los genes HSA21 ETS2 , SUMO3 , RUNX1 e indirectamente con ERG , (iii) RHOQ (familia de genes homólogos de ras, miembro Q) interactúa directamente con ITSN1 y TIAM1 e indirectamente con SYNJy (iv) PIK3R1 interactúa directamente con IFNAR1 e indirectamente con IFNAR2 . Se debe enfatizar que la información actual sobre las interacciones moleculares está lejos de ser completa, por lo tanto, es posible que perdamos interacciones importantes que aún no se han detectado y / o podemos contar falsas interacciones positivas debido a las altas tasas de error de las anotaciones actuales de las interacciones.

Varios de los genes SD. (N = 79) extrapolarse a fenotipos neurológicos más generales (Figura 3A ). El dendrograma (Figura 3D) muestra los perfiles más interesantes de estos genes en las muestras de SD. bajo análisis: (i) la expresión génica diferencial en la región cerebelo frente a todo el "cerebro" o zonas cerebrales nuevas que se ha informado en otros estudios (por ejemplo, Moldrich et al. ), (ii) diferentes patrones de expresión génica asociados a etapas de desarrollo particulares (P0, P15 y P30); estos cambios fueron reportados anteriormente por Dauphinot al., y (iii) diferencias en los estudios de ES.

Además, analizamos los estudios en humanos y ratones por separado y encontramos 182 efectos significativos de la dosis utilizando solo humanos y 107 efectos de la dosis utilizando solo datos de ratones. El diagrama de Venn en el archivo adicional, Figura S3C muestra claramente el beneficio de detectar efectos de dosis adicionales cuando se mezclan las dos especies. Se detectaron efectos de dosis superpuestas para 29 genes con ambos análisis (archivo adicional, Tabla S7). Los resultados de los análisis específicos de humanos y ratones se pueden encontrar en el archivo adicional, Tablas S8 y S9. Cabe señalar aquí que las comparaciones entre humanos y ratones que utilizan micromatrices son intrínsecamente difíciles y tienen limitaciones, ya que las sondas para los genes ortólogos de ratón y humanos no se corresponden bien. Además, la variación de la expresión génica es generalmente mayor en individuos humanos en comparación con las cepas puras de ratón. No obstante, los 107 genes encontrados en el análisis de datos de ratón (derivados de los diferentes modelos de ratón para la trisomía 21) representan un conjunto central de genes que responden a diferentes modelos de ratón SD. y, por lo tanto, podrían ser altamente relevantes para la patogénesis de la SD.

Además de los genes comúnmente relacionados con la SD, hemos identificado nuevos genes que pueden asociarse con los fenotipos de la SD, en particular con el desarrollo neuronal y la neurodegeneración. Según nuestro mejor conocimiento, este estudio es el primer metanálisis de los niveles de transcripción de todo el genoma junto con otros dominios de datos en la investigación de SD. Se puede acceder a los datos aglomerados a través del servidor WEB en http://ds-geneminer.molgen.mpg.de y los efectos de dosificación identificados son un recurso para pruebas funcionales adicionales y desarrollo terapéutico

Conclusiones.

Hemos identificado un conjunto de 324 genes con efectos de dosis consistentes de 45 experimentos diferentes relacionados con la SD. Dado que el metanálisis se enriqueció con experimentos cerebrales, pudimos detectar una alta fracción de genes relacionados con el desarrollo neurológico, la sinapsis y la degeneración neurológica. Además, nuestros resultados brindan más información sobre vías nuevas y conocidas relacionadas con SD. y también sobre 62 candidatos nuevos. Los resultados del metanálisis, así como los datos de origen, se han hecho accesibles para la comunidad a través de una interfaz WEB.

material y métodos.

Selección e integración de recursos SD.

Los conjuntos de datos se seleccionaron a partir de plataformas técnicas heterogéneas, diferentes sistemas de modelos (líneas celulares humanas, tejidos humanos, modelos de ratones) y diferentes etapas de desarrollo (archivo adicional, Tabla S1). Para cada gen y para cada fuente, calculamos un valor numérico que mide su efecto de dosificación. Las categorías de datos fueron cualitativas o cuantitativas. Los datos cualitativos incorporaron un total de 30 manuscritos publicados, incluidas revisiones y estudios semicuantitativos, así como dos estudios SAGE  y se resumieron en un punto de puntuación para evitar un puntaje excesivo. Aquí, un "1" se refiere al caso de que el gen se encontró como SD. relevante en uno (o más) estudios. Se evaluaron los datos cuantitativos de los estudios de expresión génica diferencial, tales como micromatrices Affymetrix, RT-PCR, MALDI y otras técnicas cuantitativas para extraer información comparable entre los diferentes estudios. Consideramos los estudios de Affymetrix que proporcionaron los datos sin procesar (nivel de archivo CEL). Los datos sin procesar se extrajeron de Gene Omnibus Expression (GEO), Array Express o se recuperaron de las páginas web del autor (en total 16 conjuntos de datos, incluidos tejidos humanos y cuatro modelos de ratón diferentes (Ts65Dn, Ts1Cje, Tc1 y Ts + HSA21). Además, incorporamos 18 conjuntos de datos RT-PCR y MALDI para los cuales los autores mostraron la información de todos los genes en estudio (significativos o no).

Mapeo de identificaciones genéticas

Un requisito previo central de cualquier enfoque de metanálisis es la consolidación de los diferentes tipos de ID, por ejemplo, provenientes de diferentes organismos y de diferentes versiones de chips. Utilizamos la base de datos Ensamble (versión 56) como la anotación de la red troncal para todos los estudios. Las identificaciones se asignaron a las identificaciones de genes humanos de Ensamble. El mapeo y la fusión de la información se realizó dentro de R y el paquete BioConductor. En total, se mapeó información sobre 19,388 genes ENSAMBLE.

Mapeo de ID de SAGE.

Las etiquetas expresadas diferenciales se extrajeron de archivos adicionales de los estudios. Los identificadores (basados ​​en secuencias) se etiquetaron en forma cruzada con la información que se muestra en las tablas de actualización (SAGEmap_Hs y SAGEmap_Mn) del sitio de SAGE ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/sage/mappings .

Transcriptoma datos pre-procesamiento y normalización.

Se incorporaron solo estudios de casos y controles en el metanálisis para derivar los cambios en la expresión. Las anotaciones del chip del gen Affymetrix se adaptaron de la última anotación del genoma (versión 12). Los datos de Affymetrix se normalizaron con GC RMA. Para los estudios de casos y controles de transcriptomas, se almacenaron tres partes de información para cada gen; (i) el cambio cruzado (SD. vs. controles), (ii) el error estándar del cambio cruzado de los experimentos replicados en ese estudio y (iii)la expresión p-valor (llamada de presencia) que indica si el gen se expresa o no en las muestras objetivo en estudio. Para los experimentos de RT-PCR y MALDI, calculamos el cambio en la media de la expresión (SD. vs. controles), así como el error estándar informado de la relación. Cuando se proporcionó la media y la variación estándar para cada grupo (SD. y controles), se calcularon las razones y sus errores estándar asociados.

Puntuación de los efectos de la dosis de SD. en todos los estudios.

Con el fin de calificar las diferentes categorías de información, como los recuentos binarios y los valores cuantitativos de expresión génica, resumimos las puntuaciones de los experimentos individuales para cada categoría. Para los estudios de micromatrices, la puntuación del gen i -th en el j -th estudio, s ij , se calculó como se describe en Rasche et al. :

Aquí r ij es el cambio, p ij es el valor de p de detección promedio y e ij es el error estándar de la relación derivada de las réplicas experimentales del estudio. Por lo tanto, el cambio se ponderó con su reproducibilidad en las réplicas experimentales y con la probabilidad de que el gen se exprese en el caso del estudio o en las muestras de control.

Para los estudios de RT-PCR y MALDI aplicamos la siguiente ecuación:

Aquí r ij es el cambio de plegado y e ij es el error estándar de la relación.

La puntuación total del gen se calculó como la suma de todas las puntuaciones de los estudios individuales.

Muestreo de importancia.

Para evaluar la importancia de los puntajes genéticos generales, generamos puntajes aleatorios volviendo a muestrear los puntajes 50,000 veces con reemplazo dentro del mismo estudio. Utilizando la distribución aleatoria como fondo, asignamos como significativos aquellos genes que estaban por encima del percentil 99.9 de la distribución de fondo.

Juzgando la consistencia de los efectos de la dosis.
Para cada gen, se calculó la entropía de la distribución de la puntuación para cuantificar la relevancia del gen en muchos experimentos. Sea s ij la puntuación del gen i en el estudio jth, entonces E i es una medida de la uniformidad de la distribución de la puntuación en los experimentos individuales:

La alta entropía se asigna a un gen si muchos experimentos contribuyen a la puntuación general, mientras que la baja entropía se asigna si solo unos pocos experimentos contribuyen a la puntuación general.

Análisis de enriquecimiento.

El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) de los 324 genes se realizó con respecto a vías humanas predefinidas aglomeradas a partir de 22 recursos de vías del ConsensusPathDB, http://cpdb.molgen.mpg.de) . El análisis de representación excesiva de los conjuntos de objetivos de TF se realizó con la prueba de Fisher basada en la anotación de TRANSFAC. Los análisis de enriquecimiento de los motivos se realizaron utilizando AMADEUS con genes significativos como conjuntos de objetivos y todos los genes considerados en el metanálisis como antecedentes conjunto.

Selección de experimentos cerebrales independientes.

Para probar la relevancia cerebral general de los 324 genes, recopilamos estudios de expresión génica independientes de 
SD. para descifrar las características cerebrales, realizados con la tecnología Affymetrix y, con experimentos depositados en GEO o ArrayExpress (archivo adicional, Tabla S4). Sobre todo, estos experimentos se realizaron en tejidos de ratón. Para cada estudio, recopilamos una o más listas de genes resultantes que se evaluaron mediante el Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) en comparación con la lista completa de 19,388 genes clasificados por puntaje.

Contribuciones de los autores

MV realizó las revisiones sistemáticas, recopiló los datos para el metanálisis y para los estudios relacionados. AR escribió el código general para el metanálisis. AR y MV ajustaron el código para el estudio de SD. AT creó el navegador que permite la visualización de resultados, EMD llevó a cabo el análisis del factor de transcripción. MV realizó el análisis de secuencias promotoras y el análisis estadístico adicional. RH concibió el estudio, y participó en su diseño y coordinación. MV, RH, HL y LAPJ contribuyeron a la interpretación de los datos y escribieron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

ASPECTO SOCIAL Y EDUCATIVO... [Leer más]

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Material suplementario.

Archivo adicional 1:

Tablas suplementarias . Tabla S1. Fuentes de datos utilizadas para el metanálisis. Tabla S2. Los 324 genes candidatos detectados en el estudio de metaanálisis. Tabla S3. Factores de transcripción y términos GO asociados. Tabla S4. Estudios de validación cruzada. Tabla S5. Anotación funcional de los nuevos candidatos. Tabla S6. Pliegues de cambios y datos cualitativos. Tabla S7. Datos humanos y de ratón se superponen. Tabla S8. Genes DS derivados del metaanálisis de datos humanos. Tabla S9. Genes DS derivados del metaanálisis de datos de ratón.

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Archivo adicional 2:

Figura S1 . Enriquecimiento de las categorías GO para el desarrollo de órganos, tejidos y células con respecto a los genes significativos HSA21 (barras rojas), los genes significativos no HSA21 (barras verdes) y los genes no significativos (barras azules).

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Archivo adicional 3:

Figura S2 . Localización genómica de los efectos de la dosis de DS en A) humano B) ratón. Los genes significativos están marcados en rojo, los genes no significativos en blanco.

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Archivo adicional 4:

Figura S3 . A) Categorización de los 35 estudios cualitativos, B) Categorización de los 34 estudios cuantitativos. C) Diagrama de Venn de los efectos de la dosis detectados con datos de ratón y humanos solo y con la combinación de todos los datos, D) correlación entre los valores promedio de PCR y microarrays para los 324 efectos de dosis detectados.

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Archivo adicional 5:

Figura S4 . Validación cruzada con efectos de dosificación de DS detectados con un microarray HSA21 [ 54 ]. Los diagramas de caja de las puntuaciones del metanálisis (eje Y) para los genes de clase I y II (efectos de dosificación) y de clase III y IV (compensación y expresión variable), según los autores.

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Expresiones de gratitud.

Queremos expresar nuestro agradecimiento a todos los investigadores que hicieron que los datos de SD. estén disponibles para la comunidad. El acceso gratuito a datos experimentales de alta calidad es el requisito previo necesario para todos los estudios integradores. Por otra parte, nos disculpamos por todos los conjuntos de datos que no podrían integrarse en el análisis debido a las limitaciones específicas, tales como plataformas de chips, el acceso a los datos en bruto, etc. Agradecemos a Bernhard Herrmann para dar acceso a la in situ imágenes de cerebro de ratón se muestran en la figura 3 . Damos las gracias a Marie-Laure Yaspo por las discusiones, a James Adjaye por la revisión del manuscrito ya Reha Yildirimman y a Atanas Kamburov por el soporte informático. Este trabajo fue financiado por la Comisión Europea en su sexta edición.Programa Marco con la subvención AnEUploidy (LSHG-CT-2006-037627), por la Sociedad Max Planck y la beca postdoctoral Beatriu de Pinos (2008 BP-A 00184).

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Los artículos de BMC Genomics se proporcionan aquí por cortesía de BioMed Central